Real Time PCR Cihazları

Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve Teknoloji


Dünya genelinde canlıların genetik yapısına ait bilginin elde edilmesi için yapılan çalışmalar doğrultusunda belirlenen hedefe ulaşmayı kolaylaştırmak ve hızlandırmak  için  geliştirilen yöntemlerin  en önemlilerinden birisi Polimeraz Zincir Reaksiyonu’dur (‘Polymerase Chain Reaction’, PCR).

Nükleik Asit  içerisinde (DNA, RNA) yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere ‘Polimeraz Zincir Reaksiyonu’ denir. Basitçe nükleik asidin tüp içerisinde uygun tepkime/reaksiyon koşullarının sağlanmasıyla, çoğaltılarak milyonlarca hatta milyarlarca kopyasının elde edilmesi işlemidir. Günümüzde hem araştırma hem de klinik laboratuvar alanında büyük bir yere sahip olan bu teknik, 1985 yılında Cetus adlı biyoteknoloki firması çalışanı Dr. Kary Mullis tarafından keşfedilmiş ve bu buluşu ona 1993 Nobel Kimya Ödülünü almaya hak kazandırmıştır. [1]

Bir çeşit in vitro klonlama olan PCR yöntemi; sırasıyla DNA’nın iki zincirinin yüksek sıcaklıkta (94°C-98°C) birbirinden ayrılması  (Denaturasyon); sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA’ya bağlanması (37°C-65°C) (Annealing)  ve zincirin yeni çift zincirli DNA’lar oluşturmak üzere uzaması 72°C (Extension) aşamalarından meydana gelir ve bu döngülerin belirli sayılarla tekrarlanmasına dayanır.

Bir PCR döngüsü için gerekli beş ana madde bulunur; DNA örneği, DNA, çoğaltılacak bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer; deoksi-nükleotit-trifosfatlar (dNTP); yüksek ısıya dayanıklı DNA polimeraz enzimi ve uygun pH ve iyon koşullarını (Mg+2) sağlayan tampon karışımı. [2]
PCR yöntemi; kolay, hızlı ve verimli olması gibi avantajları ile günümüzde, uygulamada öne çıkmaktadır. Birçok kullanım alanı bulunmaktadır. Başlıca ; mikrobiyolojik çalışmalar, adli tıp, in vitro kilinik tanı ve araştırma amaçlı kullanımlarda vazgeçilmez bir araçtır.

1988 yılında  PCR reaksiyonunun en önemli bileşeni olan DNA- Polimeraz enziminin, ısıya dayanıklı termofilik bir bakteriden elde edilmesi ve sonucunda ısıya dayanıklı polimerazın ( taq polimeraz) kullanımı ile birlikte polimeraz zincir reaksiyonları için (PCR) otomatize termal döngü (siklus) cihazları geliştirilmeye başlanmıştır. Floresan  ışıma tekniklerinin rol aldığı hassas ölçüm aletlerinin bu sisteme entegre edilmesi ile birlikte, reaksiyonun eş zamanlı (‘Real Time’) olarak  izlenmesi ve müdahale edilmesi (örn.PCR döngülerinin sayısının..vb. değiştirilmesi) mümkün hale gelmiştir.  Farklı terminolojilerle adlandırılabilen ( floresan kantitatif PCR, Kantitatif-kinetik PCR...vb) bu sistem genel olarak ‘Gerçek zamanlı ( ‘Real Time’)  PCR olarak adlandırılır. Ürün analizinin eş zamanlı yapılabildiği bu sistemlerde ; PCR sonrası ikincil analiz (jel elektroferez..vb.)  işlemlerinin uygulanmasına gerek kalmamaktadır. Böylece verimlilik artmakta ,kontaminasyon riski ize azalmaktadır. [3]

Real Time PCR sistemlerinin başlıca avantajlarını aşağıdaki gibi sıralayabiliriz; [4]
•Spesifik olmayan amplifikasyonlar analiz sonuçlarını etkileyememektedir.
•Eş zamanlı analiz yapılabilmektedir.
•Yaklaşık 30dk ile 2 saat arasında değişebilen hızlı döngü süreleri genel işlem süresini kısaltır.
•Dinamik aralık 1010 ‘a kadar genişleyebilmektedir.
•Spesifik erime eğrisi analizleri (Melting Curve) ve spesifik amplifikasyonlar kolayca tanımlanabilir.
•Yüksek duyarlılık, özgüllük ve tekrarlanabilirliğe sahiptir.
•Sonuç oalrak fonsiyon-fiyat oranı açısından konvensiyonel PCR’dan daha ekonomikdir.

 

Montania 4896
Montania 484


KAYNAKLAR
1.İTÜ Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, http://www.bio.itu.edu.tr, 25 Ocak 2005
2.Mullis, K. (1990). The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American April 56-65
3.Dr. Müge AYDIN-SAYİTOĞLU, Hematoloji’de Real Time PCR, İstanbul Üniversitesi, Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü, Genetik Anabilim Dalı, İstanbul
4.Mark A. Valasek and Joyce J. Repa, The power of real-time PCR, ADV PHYSIOL EDUC 29:151-159, 2005