Nükleik Asit Ekstraksiyon Cihazları

Geçmişten Günümüze İzolasyon Sistemleri,

Nükleik asit izolasyonu genel olarak; hücre membran ve çeperinin parçalanması, nükleaz aktivitesinin inaktif hale getirilmesi,solüsyonun proteinlerden arındırılması,nükleik asitin konsantre edilmesi  ve izole edilen nükleik asidin  uygun olarak depolanması aşamalarını içermektedir. [1]

Kullanılan metotları  genel olarak, geleneksel ‘sıvı-faz izolasyon’ ve günümüzde yaygınlaşan, pratik bir kullanıma sahip ‘katı faz izolasyon’ olarak ikiye ayrılır. Kullanılan başlıca geleneksel (sıvı-faz) yöntemleri;

    * ‘Guanidium Asit-Fenol metodu’,
    * ‘Alkalin izolasyon’, ‘CTAB izolasyon’,
    * ’Etidyum bromid-sezyum klorid metodu’,
    * ‘Oligo(dT) – Selüloz kromatografisi’dir.

Katı-faz yöntemler geleneksel yöntemlere göre daha hızlı, etkili sonuç vermekte, sıvı faz izolasyonda karşılaşılan faz ayrımı sorunu giderilmektedir. İzolasyon; lizis (parçalama), nükleik asidin bağlanması, yıkama ve elüsyon işlemlerini içeren dört ana aşamada gerçekleşmektedir. Örnek önce lizis tamponuyla parçalanır. Katı yüzeye (kolon)  uygun bir pH buffer uygulanarak , kolon yüzeyi veya fonksiyonel gruplar bağlanmaya uygun bir kimyasal form  haline getirilir. Lizis tamponuyla parçalanan örnek katı yüzeye (kolona) uygulanır. Uygun tampon koşulları sağlanarak (pH ve tuz konsantrasyonu)  nükleik asidin   katı yüzeye (kolon) bağlanması sağlanır. Katı yüzeye yapışan istenmeyen kontaminantlar yıkanarak uzaklaştırılır. Su veya TE buffer yardımıyla yüzeye yapışan nükleik asit, tamponu içerisinde elde edilir. Günümüzde üretilen ticari kitlerin çoğu bu yöntemi izlemektedir. Tampon çözeltideki tuz ve pH içeriğine göre nükleik asitin katı yüzeye bağlanması ve ayrılması gerçekleşir.  Katı-faz’da kullanılan katı-yüzey (destek) materyalleri  genel olarak slika matriks, cam partiküller, diatomit, manyetik tanecikler, anyon-değişim yüzeyleridir. [1],[2]

Manyetik taneciklerin katı-yüzey olarak kullanıldığı ayırma işlemi, diğer yöntemlere göre çok daha hızlı, basit, otomatik sistemlere uygulanabilir ve etkili bir yöntem olup, daha büyük ölçekte izolasyonların kolayca gerçekleştirilmesini sağlamaktadır. Manyetik izolasyon, manyetik partiküllerin mıknatıs yardımıyla ayrılması temeline dayanmaktadır. Yeterli manyetik alanı olan hücreler (magnetotaktik bakteri, kırmızı kan hücreleri)  direkt olarak ayrılabilirken, manyetik alansız hücrelerin manyetik parçacıklarla manyetik kompleksler oluşturması sağlanarak dolaylı yoldan ayrılır. [3],[4]

Nükleik asitlerin manyetik izolasyonunda  manyetik kompleks oluşturulmakta, işlem 3 aşamada gerçekleşmektedir:

* Hücre solüsyonuna, manyetik etiketler (manyetik parçacıklar) katılarak inkübasyon süreci sonrasında manyetik kompleks (ayrılması     istenen biyomolekül- manyetik parçacık kompleksi) oluşturulması,

*Manyetik kompleksin yıkanmasıyla, istenmeyen bağlanmış   kontaminantların (proteinler) uzaklaştırılması
* Elüsyon yapılarak, nükleik asidin manyetik kompleksten ayrılması.

 

Manyetik-süpermanyetik partiküller, manyetik koloidler, magnetolipozomlar ve moleküler etiketler genel olarak kullanılan manyetik  etiketlerdir.   Günümüzde yaygın olarak kullanılan otomatik nükleik asit izolasyon sistemlerinde genellikle manyetik partikül teknolojisi kullanılmaktadır. [5],[6]

 

Magnesia16
Magnesia2448


KAYNAKLAR

1) Siun Chee Tan and Beow Chin Yiap, DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present, Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2009,  Article ID 574398,  10 pages
2) Cell Separation and Protein PuriTcation (1996) Oslo, Norway: Dynal. 165 pp.
3) Safarik and Safarikova  M (1999) Use of magnetic techniques for the isolation of cells. Journal of Chromatography B 722: 33d53.
4) Olsvik , Popovic T, Skjerve E et al. (1994) Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology. Clinical Microbiology Reviews
5) Matthias Franzreb, Martin Siemann-Herzberg et al, Protein purification using magnetic adsorbent particles, Appl Microbiol Biotechnol (2006) 70: 505–516
6) Sonja Berensmeier, Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids, Appl Microbiol Biotechnol (2006) 73:495–504